Optimales Selbst

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 9483 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Lipid-Nanopartikel (LNPs) für den RNA- und DNA-Transport haben aufgrund ihrer Fähigkeit, ein breites Spektrum von Krankheiten zu behandeln und mRNA für COVID-Impfstoffe zu vektorisieren, große Aufmerksamkeit erregt. LNPs werden durch Mischen von Biomolekülen und Lipiden hergestellt, die sich selbst zu der gewünschten Struktur zusammenfügen. In diesem Bereich zeigt die Mikrofluidik klare Vorteile: hohe Mischqualität, spannungsarme Bedingungen und schnelle Vorbereitung. Studien zu LNPs, die in Mikromischern hergestellt wurden, haben in bestimmten Durchflussratenbereichen eine Verschlechterung der Leistung hinsichtlich Größe, Monodispersität und Einkapselungseffizienz ergeben. In dieser Studie konzentrieren wir uns auf den Ringmikromischer, der gut für hohen Durchsatz geeignet ist. Wir enthüllen drei Regime: Nebeneinander, Übergang und stark gemischt, die die Mischleistung des Geräts steuern. Darüber hinaus zeigen wir mithilfe von Kryo-TEM und biochemischer Analyse, dass die Mischleistungen stark mit den Eigenschaften der von uns produzierten LNPs korrelieren. Wir betonen die Bedeutung des Flussratenverhältnisses und schlagen ein physikalisches Kriterium vor, das auf dem Einsetzen zeitlicher Instabilitäten basiert, um LNPs mit optimalen Eigenschaften hinsichtlich Geometrie, Monodispersität und Verkapselungsausbeute herzustellen. Diese Kriterien gelten allgemein.

Im letzten Jahrzehnt wurden viele Fortschritte erzielt. Tatsächlich wurden seit dem Erscheinen der ersten Mikromischer zu Beginn des Jahrhunderts etwa hundert funktionale Geräte entwickelt, die auf verschiedenen Konzepten basieren. Sie alle haben Vor- und Nachteile, aber im Großen und Ganzen finden Anwender im Katalog der Mikrofluidmischer1,2,3 häufig Geometrien, die ihrer interessanten Anwendung entsprechen. In den letzten Jahren entstand die Idee, diese Geräte zur Herstellung von LNPs (Lipid-Nanopartikeln) zu nutzen4,5. LNPs haben sich zum Goldstandard für die Nukleinsäureabgabe entwickelt6. Es handelt sich um komplexe Nanopartikel mit einem Durchmesser von 50–100 nm, die hauptsächlich aus kationisch ionisierbaren Lipiden bestehen, die sich von den anderen Lipidkomponenten trennen können, wenn ihre Ladungen neutralisiert werden, was zur Bildung amorpher Öltröpfchen im Kern von LNPs führt, wie in a beschrieben aktuelle Studie7,8. Das therapeutische Molekül im LNP hängt von der Anwendung ab. Es kann DNA, mRNA oder siRNA sein. Zu den funktionellen Einheiten, die an der Grenzfläche eingeschlossen oder adsorbiert sind, gehören PEG-Einheiten (normalerweise an eine Lipidkette gebunden), Helferlipide und Cholesterin. Lipid-Nanopartikel bieten viele Vorteile gegenüber früheren lipidbasierten Nukleinsäure-Abgabesystemen: hohe Effizienz der Nukleinsäure-Verkapselung, wirksamere Transfektion, verbesserte Gewebepenetration und geringe Zytotoxizität und Immunogenität. Diese Eigenschaften machen Lipid-Nanopartikel zu hervorragenden Kandidaten für die Nukleinsäureabgabe, wie mRNA-basierte Impfstoffe gegen COVID gezeigt haben.

LNPs werden durch einen Selbstorganisationsprozess gebildet. Numerische Simulationen legen nahe, dass der Selbstorganisationsprozess drei Schritte umfasst: Partikelanordnung zu scheibenförmigen Clustern, Aggregation von Clustern zu größeren Membranflecken und Vesikelbildung9. Die Selbstorganisation durch Diffusion wäre zu langsam (sie würde Tage dauern), daher ist hydrodynamisches Mischen erforderlich. Der Einsatz von Standardmischern5 in Großgebinden ist eine Option. Allerdings erzeugen diese Mischer eine Größenpolydispersität zusammen mit einer geringen Einkapselungseffizienz. Daher sind Nachbearbeitungsschritte wie Filtration, Extrusion und Zentrifugation erforderlich, um die Qualität der auf diese Weise hergestellten LNPs zu verbessern. In diesem Zusammenhang ist der Einsatz mikrofluidischer Mischer relevant. Kürzlich wurde gezeigt, dass Mikrofluidik die Produktion von LNPs akzeptabler Qualität hinsichtlich Monodispersität und Verkapselungsausbeute in einem einzigen Schritt mit hohen Ausbeuten ermöglicht. Bei Fujishima et al.10 und Shepherd et al.11 wurde ein versetzter Fischgräten-Mikromischer12 verwendet. Eine Einschränkung der Fischgräten-Mikromischer ist ihr geringer Durchsatz. Diese Einschränkung kann durch Parallelisierung des Systems11 umgangen werden. Diese Option erzeugt jedoch Komplexität, erhöht die Kosten und verringert die Zuverlässigkeit. Eine Lösung bieten Trägheitsmikromischer, die mit deutlich höheren Flussraten und damit höheren Durchsätzen arbeiten. Allerdings sind die Bedingungen, unter denen sie betrieben werden sollten, um funktionelle LNPs zu erhalten, bisher noch nicht vollständig geklärt, obwohl sich in der Literatur einige Hinweise finden lassen.

In der vorliegenden Arbeit konzentrieren wir uns auf einen Dean-basierten Mikromischer13,14,15,16,17, ein Mitglied der Klasse der Trägheitsmikromischer. Es ist gut für hohe Durchsätze und damit für die Massenproduktion geeignet. Wir identifizieren, in guter Übereinstimmung mit numerischen Berechnungen18, drei Bereiche der Durchflussraten. Eines davon, das so genannte „Übergangsregime“, wird eine wichtige Rolle bei der Ermittlung der optimalen Strömungsbedingungen spielen. Um LNPs mit optimalen Eigenschaften hinsichtlich Einkapselungseffizienz (EE), Größe, Ladung und Monodispersität zu erhalten, zeigen wir, dass wir mit Flussraten oberhalb des Übergangsbereichs arbeiten müssen. Das Arbeiten unterhalb oder innerhalb des Übergangsbereichs, immer noch hinsichtlich der Durchflussraten, führt zu einer verminderten Leistung. In Übereinstimmung mit der Literatur skizzieren wir daher die physikalischen Bedingungen, unter denen LNPs akzeptabler Qualität erhalten werden können, und verwenden dabei ein physikalisches Kriterium, das bisher nicht vorgeschlagen wurde. Wir diskutieren auch die wichtige Rolle des Flussratenverhältnisses zwischen der wässrigen Phase (die die Nukleinsäuren enthält) und der organischen Phase (die die Lipide enthält).

In unserer LNP-Formulierung waren 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC), 1,2-Dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylenglycol-2000 (DMG-PEG2000) und Cholesterin (aus Pflanzen gewonnen) enthalten gekauft von Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA). Dlin-MC3-DNA, im Folgenden MC3 genannt, wurde von SAI Life Science (Hyderabad, Indien) erhalten. Zitronensäure und tribasisches Natriumcitrat-Dehydrat wurden von Sigma-Aldrich (Frankreich) erworben. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung 10X (PBS, pH 7,4) wurde von Thermo Fisher Scientific (Frankreich) bezogen. Das gWiz-GFP-Plasmid wurde von Aldevron (North Dakota, USA) gekauft.

Zur Herstellung von LNPs wurden Lipide in Ethanol in Molverhältnissen von 50:10:38,5:1,5 für MC3, DOPC, Cholesterin bzw. PEG-Lipid gelöst. Die Lipidmischung wurde mit 50 mM Citratpuffer bei pH 4, der pDNA enthielt, unter Verwendung der NxGen-Mikrofluidikkartusche (von Precision NanoSystems, Vancouver) gemischt. Das Stickstoff-zu-Phosphat-Verhältnis (N/P) zwischen dem ionisierbaren Lipid und der pDNA wurde bei 6 gehalten. Die Auswirkungen der Flussrate (FR; im Bereich von 0,4 bis 20 ml/min), des wässrigen zu organischen Verhältnisses (FRR; von 1:1 bis 10:1) und die endgültigen Lipid- und pDNA-Konzentrationen (von 1,44 bis 15 mg/ml bzw. 93–965 µg/ml für Lipide und pDNA) wurden bewertet. Für alle Formulierungen wurden die anfänglichen und endgültigen Abfallmengen auf 0,45 bzw. 0,05 ml festgelegt. Nachdem die Formulierung im Mikromischer verarbeitet wurde, wurde Ethanol aus dem Produkt entfernt und der Citratpuffer wurde durch PBS unter Verwendung von Amicon Ultra Centrifugal Filters (EMD Millipore, Billerica, MA) entfernt. Die Formulierungen wurden schließlich durch einen 0,22-μm-Filter geleitet und bis zur Verwendung bei 4 °C gelagert.

Die Partikelgröße, der Polydispersitätsindex (PDI) und das Zetapotential wurden durch dynamische Lichtstreuung unter Verwendung eines Malvern Zetasizer NanoZS (Worcestershire, UK) gemessen. LNPs wurden 100-fach in PBS verdünnt und in eine µ-Küvette gegeben. Der Brechungsindex (RI) und die Viskosität des Dispergiermittels (PBS) betrugen 1335 bzw. 1,02 cP, während der RI des Materials 1,45 betrug.

Die Effizienz der pDNA-Einkapselung wurde mit dem PicoGreen-DNA-Assay (Life Technologies, Burlington, ON) bestimmt. Kurz gesagt, 100 µL des verdünnten Fluoreszenzfarbstoffs wurden zu 100 µL verdünnter LNPs in Gegenwart oder Abwesenheit von 1 % (Gew./Vol.) Triton-X100 in TE-Puffer gegeben und 5 Minuten lang ohne Licht inkubiert. Nukleinsäuren wurden durch Messung der Fluoreszenz (ex/em = 480 nm/520 nm) unter Verwendung eines Fluorimeters (Varioskan Lux Microplate Reader, Thermo Fisher) quantifiziert. Mit der im Kit enthaltenen Standard-DNA-Probe wurde eine lineare Kalibrierungskurve bis zu 1000 ng/ml erstellt.

Das Verkapselungsverhältnis wurde nach folgender Formel berechnet:

Die Morphologie der LNPs wurde mittels Kryo-Elektronenmikroskopie beobachtet. Nach 90 s Glimmentladung auf einem ELMO-Ionisator (Cordouan, Frankreich) wurden insgesamt 4,1 µl konzentrierte LNPs auf Quantifoil R2/2-Kupfergittern mit 300 Mesh (Quantifoil Instruments GmbH, Deutschland) abgeschieden. Die Gitter wurden mit einem Vitrobot MARK IV (Thermo Fisher Scientific, USA) geblottet und eingefroren und auf einen TEM tecnai-G20 (ThermoFisher Scientific, USA) übertragen, der bei 200 kV unter Verwendung eines 910-Kryohalters (Gatan, Inc., USA) betrieben wurde Überwachung. Die Bilder wurden bei einer Defokussierung von 4 µm und im Niedrigdosismodus (Elektronendosen zwischen 10 und 15 e−/Å2) mit einem ssCCD Ultrascan 4000 (Gatan, Inc., USA) aufgenommen. Die Pixelgröße der aufgenommenen Bilder wurde nach TEM-Kalibrierung unter Verwendung eines Kreuzliniengitters (EMS, USA) mit einem Rasterabstand von 500 nm und 2000 Linien/mm auf 0,221 nm geschätzt.

Das zur Herstellung von LNPs verwendete mikrofluidische Gerät ist in Abb. 1 dargestellt.

(A) Bild des mit einer Fluoresceinlösung gefüllten Mikrogeräts. (B) Skizze des Mikrogeräts mit Abschn. 1, der Eintrittsbereich und Abschn. 2, einschließlich der vier Ringe und der Verbindungen zwischen ihnen. In den Flüssigkeitsmodellexperimenten ist Q1 Wasser und Q2 Ethanol mit 0,1 Gew.-% Fluorescein. In den LNP-Experimenten stellt Q1 die wässrige Phase dar, die die in einem sauren Puffer verdünnte Nukleinsäure enthält, und Q2 stellt die Ethanolphase dar, die die Lipide enthält. (C) Dreidimensionale Ansicht des Geräts, die die Keile zeigt, die mit der Formtechnik der Mikrofabrikation verbunden sind. Die Abmessungen der Kanäle wurden mittels optischer Profilometrie gemessen (siehe Abb. 2).

Das System umfasste eine Reihe von vier Tori, die durch gerade Kanäle verbunden waren. Das Gerät wurde mit Kunststoffformtechnologie (Ignite® von Precision NanoSystems Inc. Ltd., Vancouver, BC, Kanada) mikrogefertigt. Abbildung 2 zeigt den Querschnitt des Auslasskanals, der sich stromabwärts der vier Ringe befindet, wie im Einschub dargestellt (siehe die weiße gestrichelte Linie).

Querschnittsprofil des Auslasskanals (siehe gestrichelte Linie im Einschub), wobei y die horizontale Abmessung (also in der Geräteebene) und z die Höhe darstellt. Die Funktion z(y) definiert somit das Kanalprofil, wobei der Kanalboden als Referenz dient (z = 0). Es werden zwei Datensätze angezeigt: Intensitätsmessungen (Kreise), wobei Proportionalität zwischen der Fluoreszenzintensität und z(y) angenommen wird, und optische Profilometriemessungen von Veeco (rote Linien).

Das Profil in Abb. 2 wurde erhalten, indem die Kanäle mit einer Lösung aus Alkohol und Fluorescein gefüllt, mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet, das Intensitätsfeld mit einer Kamera erfasst und die Bilder mit einem Computer analysiert wurden. Je größer die Höhe des Kanals ist, desto stärker ist die gesammelte Intensität. Wir arbeiteten mit niedrigen Fluoresceinkonzentrationen (0/1 % w/w), um ein Bleichen zu vermeiden, und gingen von einer Proportionalität zwischen der von der Kamera erfassten Fluoreszenzintensität und der Kanalhöhe aus. Wir haben überprüft, ob die auf diese Weise erhaltenen Profile vollständig mit der optischen Profilometrie übereinstimmen (siehe die rote Linie in Abb. 2, erhalten mit dem optischen Profilometer Veeco). Aufgrund der verwendeten Mikrofabrikationstechnik (Spritzguss) waren die Kanalwände nicht vertikal, sondern leicht geneigt. Aus Abb. 2 wurden Winkel von etwa 80° ermittelt, die durch Opposition mit dem zentralen Teil des Kanals, dessen Höhe konstant ist, das bilden, was wir „Keile“ nennen. In diesem Zusammenhang definieren wir die Kanalbreite w als den Abstand zwischen den beiden geneigten Wänden auf der Ebene der Mittelebene. In unserer Mischungsanalyse werden wir diese Keile vernachlässigen und uns auf die zentralen Teile konzentrieren, die den größten Teil des Materials transportieren, das wir produzieren wollen (im Keil ist das Fluid aufgrund des Einschlusses dem gleichen Druckgradienten ausgesetzt wie im zentralen Teil). (Teil davon ist im Wesentlichen stagnierend, und wir können davon ausgehen, dass es nicht zum Produktionsprozess beiträgt). Die anhand der optischen Profilometrie geschätzte Oberflächenrauheit betrug 3 ± 1 µm. Dies ist typisch für die Injektionstechnik ohne Oberflächennachbearbeitung. Da die Strömung deutlich unterhalb des Turbulenzbeginns angetrieben wird (siehe unten), spielt diese Rauheit keine dynamische Rolle.

Die Kanäle haben die gleiche Tiefe (155 µm – gemessen mit optischer Profilometrie –) und unterschiedliche Breiten. In Abb. 1 sind die Tori 150 µm breit, die Verbindungskanäle 150 µm und die Einlass- und Auslasskanäle 280 µm breit (wie in Abb. 2 dargestellt). Das Gerät verfügt über zwei Einlässe. Die Eintrittskanäle bilden ein Y, das mit dem ersten Torus verbunden ist.

Die Gesamtdurchflussrate wird durch Q = Q1 + Q2 definiert, wobei Q1 und Q2 die Durchflussraten der an den beiden Einlässen eingespritzten Flüssigkeiten sind (siehe Abb. 1). In unserem System wurden zwei Arten von Experimenten durchgeführt:

Modellflüssigkeitsexperimente: In diesem Fall entspricht Q1 entionisiertem Wasser und Q2 der Fluorescein-Ethanol-Lösung mit einer Massenkonzentration von 0,1 %.

LNP-Experimente: In diesem Fall stellt Q1 die wässrige Phase dar, die die Nukleinsäure in einem sauren Puffer enthält, und Q2 stellt die Ethanolphase mit den vier solubilisierten Lipiden dar.

Wir definieren auch das FRR (Durchflussverhältnis) durch die Beziehung \(QR = \frac{{Q_{1} }}{{Q_{2} }}\). Die meisten Arbeiten konzentrierten sich auf FRR = 3, dh eine Wasserdurchflussrate, die dreimal so hoch ist wie die Durchflussrate der Ethanollösung. Die Gesamtdurchflussrate Q wurde von 0,2 bis 20 ml/min variiert. Wir definieren eine charakteristische Geschwindigkeit U als Gesamtdurchfluss Q dividiert durch den Querschnitt des Einlasskanals, also kurz vor Ring 1 (siehe Abb. 1). Die Reynolds- und Dean-Zahlen werden durch die folgenden Ausdrücke definiert:

Dabei ist h die Kanalhöhe, ν die kinematische Viskosität von Wasser und R der Krümmungsradius des Tori. In dem von uns getesteten Bereich der Durchflussraten schwanken die Reynolds-Zahlen zwischen 10 und 1100, während die Dean-Zahlen zwischen 4 und 400 liegen. Wir lagen somit deutlich unter den Turbulenzentwicklungsregimen, die möglicherweise eine genaue Kontrolle der Wandrauheit erfordert hätten. Aus dimensionaler Sicht hängt unser System von diesen beiden Zahlen ab, zusammen mit Seitenverhältnissen und einer dimensionslosen Zahl, die den Diffusionsprozess charakterisiert. Der Parameterraum ist groß, und in diesem Artikel werden wir die Observablen als Funktion der Durchflussraten darstellen (die aus praktischer Sicht nützlich sind), ohne zu versuchen, die Schlussfolgerungen durch die Verwendung dimensionsloser Zahlen zu verallgemeinern.

Für die Fluidmodellexperimente wurde die Charakterisierung des Mischprozesses mithilfe von Visualisierungstechniken durchgeführt. An einem Eingang wurde Fluorescein injiziert, und die am anderen Eingang injizierte Flüssigkeit enthielt keinen Farbstoff. Das System wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, das mit einer Quelle bei 480 nm und einem Kamerafilter bei 520 nm, also rund um den Emissionspeak, ausgestattet war.

Wie in der Fachliteratur üblich19 liefert die Untersuchung des Fluoreszenzintensitätsfeldes Informationen über die Mischung. Ebenso definieren wir einen Mischungsindex H durch die Formel:

Dabei ist y die Koordinate quer zur Strömung, w die Kanalbreite und \(I_{mean}\) die durchschnittliche Intensität über die Kanalbreite. Per Definition ist die Durchmischung hoch, wenn H nahe bei Eins liegt. Im umgekehrten Fall (kleines H) ist die Durchmischung gering.

Wir haben zunächst niedrige Flussraten in Betracht gezogen und das Flussratenverhältnis FRR auf 3 gehalten. Die Wahl dieses Werts wurde durch die Tatsache motiviert, wie später gezeigt wird, dass er die Bildung von LNPs mit der geeigneten Größe für die DNA- oder RNA-Abgabe ermöglichte ( ca. 100 nm), eine enge Größenverteilung und eine hervorragende Verkapselungseffizienz. Ein typisches Bild des Fluoreszenzfeldes bei niedrigen Flussraten ist in Abb. 3A dargestellt.

(A) Fluoreszenzfeld des Mikromixers für eine Gesamtdurchflussrate Q von 0,2 ml/min. Einfügung: Theoretische Tracerverteilung, wenn der Farbstoff den Stromlinien ohne Diffusion folgte, für die wir keine Rezirkulation angenommen haben. (B) Intensitätsprofile im Auslassbereich des Systems für Q = 0,2 (offener Kreis) und 0,3 (Kreuze) ml/min. Die gestrichelte Linie zeigt die Mitte der Diffusionsschicht und die grauen Bereiche zeigen die im Abschnitt „Materialien“ besprochenen Keile. Die Messungen wurden im Auslasskanal, also stromabwärts des vierten Rings durchgeführt (siehe gestrichelte Linie). Graue Zonen sind die Kanalkeile.

In Abb. 3 beträgt die Durchflussrate Q2 der Ethanollösung 0,05 ml/min, während Wasser mit einer Durchflussrate Q1 von 0,15 ml/min eingespritzt wird, sodass die Gesamtdurchflussrate Q = Q1 + Q2 0,2 ml/min beträgt. Mindest. Wie oben angegeben, beträgt das Durchflussverhältnis FRR 3. Abbildung 3 zeigt, dass sich die beiden Flüssigkeiten im Sammeleintrittskanal nebeneinander bewegen. Das Intensitätsprofil in Abb. 3B zeigt das Vorhandensein einer diffusen Schicht. Die gemessene Dicke der diffusen Schicht lag in der Größenordnung von 60 µm, was größer war, aber in der gleichen Größenordnung wie die Schätzung \(l \sim 6\sqrt {DT }\) der diffusen Schichten basierend auf der Fehlerfunktion ( Dabei ist D die Fluorescein-Diffusionskonstante in Ethanol (2 · 10–10 m2/s) und T die Laufzeit (30 ms für 0,2 ml/min)). Die Formel führt zu einer Dicke l in der Größenordnung von 30 µm. Wir vermuten, dass der Faktor 2 auf die Wirkung schwacher Rezirkulationen zurückzuführen ist, die im System auch bei geringen Durchflussraten vorhanden sind und am Eingang lokalisiert sind oder sich entlang der Ringe entwickeln. So klein diese Rezirkulationen auch sein mögen, sie können den diffusiven Transport erheblich verbessern.

Abbildung 3A zeigt somit, dass Ethanol und Wasser nebeneinander fließen. In einem solchen Regime gelten die folgenden Ausdrücke19,20.

Dabei sind µe und µw die Viskositäten von Ethanol bzw. Wasser. Die Formel besagt, dass die Fluorescein-Ethanol-Mischung 30 % der Kanalbreite einnimmt. Dies lässt sich gut mit Abb. 2 vergleichen, in der die gestrichelte Linie, die die Mitte der diffusen Schicht markiert, bei 35 % der Kanalbreite liegt. Der Einschub in Abb. 3A zeigt das Strömungsmuster, das wir erwarten würden, wenn es keine Wirbelbewegung gäbe und die Diffusion vernachlässigt würde.

Als die Gesamtflussrate Q im Bereich von 0,7–4 ml/min erhöht wurde, immer noch mit FRR = 3, nahmen die zeitlich gemittelten Konzentrationsprofile komplizierte Formen an, die von einer Flussrate zur anderen erheblich variierten, obwohl die Unterschiede zwischen beiden bestehen aufeinanderfolgende Werte betrugen nur 10 %. Daher besteht in dieser Region eine hohe Variabilität. Wir nennen diesen Bereich den „Übergangsbereich“ und die entsprechenden Regime „Übergangsregime“. Abbildung 4A zeigt ein typisches Konzentrationsfeld und Abbildung 4B ein typisches Konzentrationsprofil, das in diesem Bereich erhalten wurde, erneut gemessen, im Auslass-Mikrokanal (siehe Pfeil).

Fluoreszenzfeld von Fluorescein, das im Gerät durch Ethanol für Q1 = 1,5 ml/min (Wasser) und Q2 = 0,5 ml/min (Ethanol) transportiert wird: (A) Momentanbild des Fluoreszenzfeldes. (B) Zeitgemitteltes (über eine Minute) Intensitätsprofil, gemessen nach dem vierten Ring (siehe Pfeil), also im Auslasskanal. Graue Zonen sind die Kanalkeile.

In diesem Fall drang der Tracer in den Kanal ein, jedoch nicht vollständig: Das über eine Minute gemittelte Konzentrationsprofil zeigt einen deutlichen Abfall um die Mittellinie. Die Durchmischung war daher nicht vollständig, da einige Regionen gut und andere weniger durchmischt waren. Eine wichtige Beobachtung ist, dass im Übergangsbereich Fluorescein in den Kanal eindrang, bevor es in den ersten Torus gelangte. Dies deutet darauf hin, dass sich an der Verbindungsstelle der beiden Flüssigkeiten ein Transportmechanismus entwickelt hat. Wie in Abb. 3A gezeigt, neigte die Farbstoffkonzentration dazu, sich zu homogenisieren, während wir uns flussabwärts bewegten, aber es blieben immer noch Heterogenitäten im Auslasskanal, wie in Abb. 3B gezeigt.

Ein interessantes Merkmal, das wir im Bereich von 1–4 ml/min beobachteten, war das Vorhandensein zeitabhängiger Phänomene, wie in Abb. 5 dargestellt.

(A) Momentanes Fluoreszenzbild, aufgenommen kurz vor Ring 2 für Q = 1,5 ml/min, wobei die FRR immer gleich 3 bleibt. (B) Momentane Intensität gemessen an dem durch den Pfeil in der linken Abbildung angezeigten Punkt. Die Positionen der scharfen Grenzflächen variierten im Laufe der Zeit, was zu Schwankungen der lokalen Fluoreszenzintensität führte, die im Intensitäts-Zeit-Diagramm auftraten. Die Reynolds-Zahlen, die den im Diagramm angezeigten Durchflussraten entsprechen, betragen von der niedrigsten bis zur höchsten Durchflussrate 11, 80 und 330.

Um Abb. 5 zu erhalten, haben wir die momentane Intensität der Fluoreszenz an einem festen Punkt für verschiedene Flussraten gemessen. Die Position des Messpunkts ist in Abb. 5A mit einem weißen Punkt gekennzeichnet. Abbildung 5B zeigt, dass es bei 0,2 ml/min keine signifikante Schwankung der lokalen Intensität gab. Bei 1,5 ml/min waren lokale Schwingungen sichtbar, die durch Verschiebungen der Fluorescein/Wasser-Grenzfläche hervorgerufen wurden. Ihre Amplitude verschwand bei höheren Flussraten (siehe Kurve bei 6 ml/min). Diese Messungen liefern Hinweise auf das Vorhandensein zeitabhängiger Phänomene im System. Sie entwickelten sich in einem engen Flussratenbereich, der ungefähr zwischen 1 und 4 ml/min lag. Wir gehen davon aus, dass der Fluss bei größeren Flussraten immer noch instationär war, aber die Kopplung zwischen den hydrodynamischen Schwingungen, die dazu neigen, das Fluoreszenzfeld zu streifen, wie derzeit bei chaotischem Mischen beobachtet wird19, und der molekularen Diffusion, die es effizient glättet, erzeugte schließlich ein homogenes Konzentrationsfeld. Der Grenzfall der vollständigen Durchmischung ist in Abb. 6A gut dargestellt.

(A) Fluoreszenzfeld, das vom Mikromischer für Q = 20 ml/min entwickelt wurde; (B) Drei zeitlich gemittelte Konzentrationsprofile für Q gleich 6 (Kreise), 14 (Kreuze) und 20 (plus) ml/min. Graue Zonen sind die Kanalkeile.

Die Abbildung zeigt, dass der Tracer, bis auf einen kleinen Bereich um den ersten Ring herum, gleichmäßig im gesamten Gerät verteilt ist. Die entsprechenden Konzentrationsprofile sind in Abb. 6B für drei Flussraten, 6, 14 und 20 ml/min, dargestellt, wobei immer noch FRR = 3 eingehalten wird. Diese Profile werden wiederum auf der Höhe des Sammelkanals in der Nähe des Auslasses gemessen (siehe). gestrichelte Linie in Abb. 6A), kollabieren aufeinander.

Abbildung 7 stellt die Entwicklung des zuvor definierten Homogenitätsfaktors H dar, der im Auslasskanal für einen Bereich von Durchflussraten gemessen wurde, der die drei ausgewählten Bereiche umfasst, wobei wiederum das Durchflussverhältnis FRR = Q1/Q2 gleich 3 bleibt.

Entwicklung des Mischungsindex H als Funktion der Gesamtdurchflussrate Q für einen FRR von 3, mit typischen Sofortbildern von Fluorescein. Jeder Punkt ergibt sich aus einem Durchschnitt von einer Minute. Die durchgehende Linie dient als Orientierung für die Augen.

Die Daten werden im halblogarithmischen Maßstab aufgetragen und der Homogenitätsfaktor H wurde durch Ausschluss der Keile ermittelt, wobei, wie oben erwähnt, berücksichtigt wurde, dass sie keinen wesentlichen Beitrag zum Produktionsprozess leisten. Die drei Regime, die wir anhand dieser Messungen identifiziert haben, sind die folgenden:

Q < 0,4 ml/min: Schlechte Vermischung, verbunden mit Nebenflussströmen. Der Homogenitätsfaktor H ist klein, etwa einige Prozent. Die entsprechende obere Reynolds-Zahl dieses Regimes beträgt 22.

0,4 < Q < 4 ml/min: Übergangsregime, verbunden mit mäßiger Durchmischung, zusammen mit komplexen Konzentrationsprofilen und zeitabhängigen Phänomenen. Der Homogenitätsfaktor H liegt zwischen 20 und 80 %. Bezogen auf die Reynolds-Zahlen liegt der Bereich zwischen 22 und 220. Die Variation von H von einer Messung zur anderen ist typisch für Systeme mit Strömungsinstabilitäten, auch wenn sie im Vergleich zur charakteristischen Zeit der Schwingung über lange Zeiträume gemittelt werden entwickeln. Diese Streuung steht im Einklang mit den oben gemachten Bemerkungen zur Variabilität der Konzentrationsprofile mit den Strömungsbedingungen.

Q > 4 ml/min: Stark gemischtes Regime mit Homogenitätsfaktoren über 80 % und flachen, reproduzierbaren Konzentrationsprofilen. Der Reynolds-Zahlenbereich liegt zwischen 220 und dem im Experiment erreichten Maximalwert, also 1100.

Für die Diskussion von Abb. 7 ist es interessant, das System in zwei Teile aufzuteilen, wie in Abb. 1B skizziert:

Abschnitt 1: Der Eingangsbereich, einschließlich der V-Kreuzung und des Verbindungskanals zum ersten Ring.

Abschnitt 2: Der Rest des Systems, einschließlich der Ringe, der Verbindungen zwischen zwei aufeinanderfolgenden Ringen und des Auslass-Mikrokanals.

Unsere Beobachtungen können mit denen von Minakov18 verglichen werden, bei dem zwei mischbare Flüssigkeiten an einer T-Verbindung in einen geraden Kanal injiziert wurden. Die Geometrie ähnelte somit unserer, außer dass wir eine Y-Verbindung anstelle einer T-Verbindung verwendeten. Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden experimentell qualitativ bestätigt21. Diesen Referenzen zufolge entwickeln sich oberhalb eines bestimmten Schwellenwerts, der auf Re ≈ 20 geschätzt wird, symmetrische, S-förmige Wirbel vom Dean-Typ in der Verbindungsstelle. Dieser Schwellenwert liegt nahe an unserem (geschätzter Wert 22). Oberhalb dieses Bereichs entwickelt sich ein asymmetrisches stetiges Muster bis zu Re ≈ 150. Die Entwicklung oszillatorischer Instabilitäten tritt bei 240 auf, was zu einer periodischen Verschiebung eines Sattelpunkts führt, was gemäß dem Poincaré-Melnikov-Szenario zu einer chaotischen Vermischung führt. Tatsächlich zeigt Minakovs Arbeit eine effiziente Durchmischung direkt nach dem Einsetzen zeitabhängiger Strömungen18. Dieser Bereich der Reynolds-Zahlen stimmt mit dem Regime überein, das wir „Übergangsregime“ nannten, in dem das Seitenströmungsregime nicht gilt, die Durchmischung moderat ist, Heterogenitäten vorhanden sind und sich Oszillationen entwickeln. In unserem Fall erstreckt sich das Übergangsregime von einer Reynolds-Zahl von 22 bis 220, was nicht so weit gefasst ist wie Minakovs Ergebnisse, aber mit diesen übereinstimmt. Wir können daher vorschlagen, dass unser „Übergangsregime“ geformte Wirbel, asymmetrische Wirbel und oszillierende Wirbel umfasst. Es ist bekannt, dass oszillierende Wirbel unter dem Gesichtspunkt der Mischung äußerst effizient sind19. Dies könnte erklären, warum wir kurz vor Beginn der Schwankungen das erreichen, was wir „stark gemischte Regime“ nennen. Daher liefert der Vergleich mit der Arbeit von Minakov Hinweise, um das Verhalten unseres Mikromischers auf semiquantitativer Basis zu verstehen.

Es gibt Hinweise darauf, dass die vier Ringe die Homogenisierung des Farbstoffs verbessern. Dies ist in Abb. 5 dargestellt, die zeigt, dass Inhomogenitäten am Eingang des Geräts tendenziell geglättet werden, wenn wir uns stromabwärts bewegen. Bei den Ringen lassen sich zwei Teile unterscheiden: Der eine ist der Ring selbst (Teil 1) und der andere (Teil 2) ist der Sammelkanal, also der Bereich, in dem sich die beiden Flüssigkeiten wieder treffen. Teil 1 spielt bei der Vermischung vermutlich eine untergeordnete Rolle, da die Krümmung im Vergleich zu den Verbindungsstellen (dh Teil 2 oder dem V-Eingang) kleiner ist und daher die möglicherweise entstehenden Dean-Wirbel schwächer sind. Andererseits kann Teil 2 als Y-Verbindung betrachtet werden, die eine ähnliche Rolle wie der Eingang spielt und somit die Durchmischung verbessert. Tatsächlich legen die experimentellen Beobachtungen, die wir gemacht haben, nahe, dass Vermischungsereignisse zunächst am Eingang beginnen, also in Abschn. 1 und wiederholen Sie in Teil 2 die Ringe. Daher können wir vorschlagen, dass Teil 2 die Arbeit von Teil 1 in Bezug auf das Mischen ergänzt, sie jedoch nicht initiiert.

Die Frage, mit der wir uns nun befassen, ist die Beziehung zwischen den zuvor analysierten Mischeigenschaften und den mit demselben Mikromischer erhaltenen LNP-Eigenschaften. Zur Durchführung dieser Untersuchungen wurde ein LNP-pDNA-Modell verwendet. LNPs wurden unter Verwendung des gebrauchsfertigen und im Handel erhältlichen gWiz-GFP-Plasmids22,23 und vier verschiedenen Lipiden mit optimalen Molverhältnissen von ionisierbarem Lipid/DSPC/Cholesterin/PEG-Lipid von 50/10/38,5/1,5 und einem N hergestellt /P-Verhältnis von 6 für die Amingruppe des ionisierbaren Lipids zu den Phosphatgruppen der pDNA, wie in der Literatur beschrieben24,25. Das ionisierbare MC3-Lipid (DLin-MC3-DMA) wurde ausgewählt, da es das klinisch fortschrittlichste Oligonukleotid-Abgabesystem26,27 ist und auch im Handel erhältlich ist. Das Molverhältnis zwischen allen Komponenten wurde konstant gehalten und entsprechend der Literatur gewählt.

Wir untersuchten daher den Einfluss der Gesamtflussrate Q auf die LNP-Größe, die Größenvariabilität (PDI – Polydispersitätsindex), das ζ-Potenzial und die Einkapselungseffizienz (EE). Diese Arbeit stellt die zuvor definierten „LNP-Experimente“ dar. Diese Schlüsselmerkmale werden normalerweise bereits in den frühen Entwicklungsstadien gemessen, um den Prozess zu steuern und die Wirksamkeit und Sicherheit des Endprodukts sicherzustellen. Der Literatur zufolge sollten die LNP-Größen idealerweise etwa 100 nm oder weniger betragen, um eine optimale Bioverteilung und eine effiziente Arzneimittelabgabe zu gewährleisten28; Der PDI sollte unter 0,2 liegen, um die Produkthomogenität zu zertifizieren. und Zetapotentiale sollten leicht negativ und die Einkapselungseffizienz so hoch wie möglich sein, um eine hohe Prozessausbeute und Nukleinsäureschutz zu gewährleisten.

Um die Korrelation dieser Parameter mit den Flussbedingungen zu analysieren, wurden fünf Flussraten Q im Bereich von 0,4 ml/min bis 20 ml/min untersucht. In diesen Experimenten wurde auf die gleiche Weise wie oben beschrieben das Verhältnis zwischen wässrigem und Lösungsmittelstrom bei 3 gehalten und die Gesamtlipidkonzentration (1,44 mg/l) und die chemische Zusammensetzung wurden konstant gehalten. Die Daten sind in Abb. 8 dargestellt.

Entwicklung verschiedener Mengen mit der Flussrate zwischen 0,4 und 20 ml/min (A) LNP-Größen; (B) PDI (Polydispersitätsindex der LNPs); (C) Kapselungseffizienz.

Abbildung 8A zeigt, dass bei niedrigem Q (< 1 ml/min) größere Partikel erhalten wurden. Nach einer Übergangszone, in der die Größen abzunehmen schienen, erreichten die Partikelgrößen bei höheren Durchflussraten, also zwischen 4 und 20 ml/min, ein Plateau bei etwa 100 nm. In der Zwischenzeit nahm die Nanopartikeldispersität (PDI) mit zunehmender Flussrate ab und pendelte sich für Q > 4 ml/min bei 7 % ein (siehe Abb. 8B). Parallel dazu lag der EE bei etwa 60 % unter 2 ml/min, während Partikel, die bei höherem Q, über 4 ml/min, gebildet wurden, einen EE von etwa 80 % aufwiesen (siehe Abb. 8C). Diese Ergebnisse stimmten mit den Ergebnissen der von uns durchgeführten Mischstudie überein. Wir haben in derselben Grafik die Grenzen der drei Zonen eingezeichnet, die wir in Abb. 7 herausgegriffen haben, dh die schwach gemischten Regionen, die Übergangsregionen und die stark gemischten Regionen. Bemerkenswert ist, dass die Eigenschaften der LNP-Struktur gut mit den Mischeigenschaften des Geräts korrelieren. Darüber hinaus wurde auch das ζ-Potential gemessen, das die effektive Oberflächenladung29 angibt. Unabhängig von der verwendeten Flussrate zeigten alle LNPs ein Zetapotential von ζ = − 13 mV + /− 4 mV bei pH 7,4 und waren somit leicht negativ. Die Messung stimmte mit Ref25 überein und deutete auf einen Verlust der positiven Ladung des ionisierbaren Lipids hin.

Aus praktischer Sicht können wir daraus schließen, dass bei nicht zufriedenstellender Durchmischung (d. h. bei einem Homogenitätsindex H unter 80 %) die Eigenschaften der erzeugten Strukturen nicht optimal sind, wohingegen sie bei hoher Durchmischung ein Optimum erreichen (H größer als 80 %) und die Intensitätsprofile sind über den gesamten Kanal hinweg homogen. Wir schlagen vor, dass das Arbeiten oberhalb der Übergangszone, genauer gesagt deutlich oberhalb der Bedingungen, unter denen sich oszillierende Strömungen entwickeln, zu optimalen LNPs führt.

Wie in Roces et al.5 beschrieben, ist es wichtig, sich mit der Rolle des Flussratenverhältnisses FRR zu befassen. Abbildung 9 zeigt die Ergebnisse für den LNP-Durchmesser D, den PDI und die Einkapselungseffizienz EE für eine Gesamtflussrate von 4 ml/min und verschiedene FRR-Werte, die zwischen 1 und 10 variieren.

Diagramme für eine Gesamtdurchflussrate von Q = 4 ml/min. (A) LNP-Durchmesser D als Funktion der FRR (d. h. Wasser-zu-Ethanol-Lösungsdurchflussverhältnis). Einschub: PDI als Funktion von FRR. (B) Kapselungseffizienz EE als Funktion von FRR. Einschub: Homogenitätsfaktor H als Funktion von FRR. (C): Normalisierte Größen aufgetragen als Funktion von \(\varepsilon_{m} = \frac{{FRR\varepsilon_{w} + \varepsilon_{e} }}{FR + 1}\); \(D^{*} = 1 + 4\frac{{D - D_{\infty } }}{{D_{\infty } }}\left( + \right);\) \(PDI^{*} = PDI/PDI_{\infty }\)(o) und \(EE^{*} = E_{\infty } /EE\) (x).

Bei einem FRR kleiner als 2 waren die LNP-Eigenschaften nicht „optimal“ (im oben definierten Sinne): Durchmesser über 100 nm (Abb. 9A), niedriger EE (Einschub in Abb. 9B) und hoher PDI (Abb. 9C). wurden beobachtet. Bei einem größeren FRR haben wir die optimalen Eigenschaften wiederhergestellt, dh Durchmesser nahe 100 nm, große EE und kleine PDI (in der Größenordnung von 6 %). Es ist wichtig zu beachten, dass die Durchmischung in allen Fällen, dh bei allen FRRs, hoch war, wie der Einschub in Abb. 9B zeigt: Der Homogenitätsfaktor H betrug im Durchschnitt etwa 80 %. Wir können daraus schließen, dass der Ursprung der strukturellen Pathologien des LNP bei FRR < 2 nicht auf unzureichende Durchmischung zurückzuführen ist.

Abbildung 9C ermöglicht es uns, eine Erklärung vorzuschlagen. Wenn Ethanol (relative Dielektrizitätskonstante εe = 25) und Wasser (relative Dielektrizitätskonstante εw = 78) gemischt werden, ist die effektive (relative) Dielektrizitätskonstante der Mischung gleich \(\varepsilon_{m} = \frac{{FRR\ varepsilon_{w} + \varepsilon_{e} }}{FR + 1}\). Abbildung 10C zeigt die Entwicklung des Durchmessers D, des PDI und der Einkapselungseffizienz EE in normalisierten Formen als Funktion von \(\varepsilon_{m}\). Konkret haben wir die folgenden Größen dargestellt: \(D^{*} = 1 + 4\frac{{D - D_{\infty } }}{{D_{\infty } }},\) \(PDI^{* } = PDI/PDI_{\infty }\) und \(EE^{*} = E_{\infty } /EE\), wobei '\(\infty^{\prime }\) der bei FRR erhaltene Wert ist > 4 ml/min. Bei einem hohen FRR liegt \(\varepsilon_{m}\) nahe an dem von Wasser und die LNPs haben optimale Eigenschaften, während bei einem kleinen FRR \(\varepsilon_{m}\) wesentlich kleiner ist, was die Energielandschaft betrifft ' durch die LNP-Bestandteile verändert wird, und wir können annehmen, dass dies den Selbstorganisationsprozess und damit die LNP-Morphologien nachteilig beeinflusst. Eine solche Situation tritt auf, wenn in der Formulierung große Mengen Ethanol verwendet werden24,30,31,32. Aus Abb. 9C schätzen wir, dass der Übergang zwischen dem nichtoptimalen und dem optimalen Fall um eine effektive relative Dielektrizitätskonstante \(\varepsilon_{m}\) nahe 60 liegt, immer noch für Q = 4 ml/min, was a entspricht Durchflussverhältnis (FRR) in der Größenordnung von 2.

Kryo-TEM-Bilder von LNPs bestehend aus MC3, DOPC, PEG-Lipid und Cholesterin mit einer molaren Zusammensetzung von jeweils 50/10/1,5/38,5, erhalten bei unterschiedlichen Flussraten und mit einer FRR von 3. (A) LNPs hergestellt in das Fehlen von Nukleinsäure bei 4 ml/min. (B) pDNA-LNP-Systeme, die mit p-DNA bei 4 ml/min hergestellt wurden und strukturiertere Oberflächen zeigen. (C) pDNA-LNP-Systeme, hergestellt mit 0,4 ml/min. Die Größen sind größer und die Verteilung breiter (siehe das Vorhandensein kleiner und großer LNPs).

Aus dieser Bemerkung können wir schließen, dass die FRR optimalerweise gleichzeitig groß genug sein muss, um die Polarität der Lösung nahe an der von Wasser aufrechtzuerhalten, und klein genug, um das Erreichen hoher Verdünnungen zu vermeiden, die die Ausbeute des Prozesses verringern würden.

Hier analysieren wir die Morphologie der Nanopartikel, die in den stark gemischten Regimen bei 4 ml/mn und FRR = 3 produziert werden. Wir verwendeten Kryo-TEM und berücksichtigten zum Vergleich LNPs ohne pDNA („leere“ LNPs) und mit Nukleinsäuren (pDNA-LNPs). Wir haben die Ergebnisse auch mit denen von schlecht gemischten Regimen verglichen, wie in Abb. 10 dargestellt.

In den gut gemischten Bereichen stimmte die durch Kryo-TEM beobachtete Größe (nahe 100 nm) mit den DLS-Messungen überein. Wir fanden heraus, dass leere LNPs glatte Kugelformen hatten, wohingegen pDNA-LNPs eine gewellte Grenzfläche aufwiesen (Abb. 10B). Es ist wahrscheinlich, dass dieses Phänomen durch die Einwirkung eingekapselter DNA-Stränge auf die Lipidschicht verursacht wird. Auf jeden Fall fanden wir heraus, dass die elektronendichte Kernstruktur von Abb. 10 mit den in der Literatur beschriebenen funktionellen LNPs auf Säurebasis übereinstimmt5,8,24,33. Wir können daher den Schluss ziehen, dass die von uns gefundenen Strukturen unter stark gemischten Bedingungen und mit FRR = 3 „optimal“ in dem Sinne sind, dass sie mit den in der Literatur abgebildeten funktionellen LNPs übereinstimmen. Wenn LNPs unter niedrigen Mischbedingungen (0,4 ml/min, „Side-by-Side-Regime“) hergestellt werden, werden die gleichen Arten von Strukturen beobachtet, aber die Populationen scheinen größere Größen mit breiteren Verteilungen anzunehmen, was mit Abb. 8A übereinstimmt.

Die oben dargestellten Ergebnisse zeigen, dass eine akzeptable LNP-Qualität (geringe Größe, niedriger PDI, schwach negative ζ-Potenziale und hoher EE) erhalten wird, wenn zwei Bedingungen erfüllt sind: eine homogene Mischung der beiden Phasen, die zur Formulierung des LNP verwendet werden, mit einem größeren Homogenitätsfaktor als 80 % und eine Phasenverteilung, so dass die mittlere relative Dielektrizitätskonstante der Mischung größer als 60 ist. Dies ist der Bereich von Bedingungen, die wir für die Herstellung funktioneller LNPs empfehlen können. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass unabhängig von der Mischergeometrie die LNP-Größen, die Größenhomogenität und die Verkapselungseffizienz erheblich von den optimalen Werten abweichen, wenn eine der beiden Bedingungen nicht erfüllt ist.

Es ist interessant zu fragen, warum es bei niedrigen Durchflussraten zu anomalen LNPs kommt. Es werden wesentlich größere Größen und geringere Einkapselungseffizienzen als bei den optimalen Strukturen erhalten. Das Fluoreszenzprofil in Abb. 3 zeigt das Vorhandensein einer diffusen Schicht mit einer Dicke von 60 μm, die die beiden Flüssigkeiten trennt. In der Mitte dieser Schicht beträgt das Wasser/Ethanol-Verhältnis etwa 1:1. Wir können daraus schließen, dass in dieser Region die optimalen Selbstorganisationsbedingungen nicht erfüllt sind. Andererseits sind Lipide und pDNA massiver als Wasser und Ethanol und diffundieren daher langsamer. Während sich die Reagenzien flussabwärts bewegen, wird es Zeiträume geben, in denen Lipide dieser suboptimalen Umgebung ausgesetzt sind und dadurch ausfallen. Diese Argumentation könnte die ungewöhnlichen Größen und geringen Leistungen erklären, die bei den schlechten Mischsystemen beobachtet wurden.

Bemerkenswerterweise behielten die LNPs bei den höchsten von uns vorgegebenen Flussraten ihre Integrität bei, was darauf hindeutet, dass sie nicht zerfielen. Dies kann dadurch verstanden werden, dass trotz der hohen Geschwindigkeit (dh cm/s) auf der Skala des LNP, dh 100 nm, die Scherspannungen niedrig sind. Sollten wir die Systemgröße vergrößern, wäre es kein Problem, die Strömungsgeschwindigkeit und damit den Durchsatz zu erhöhen, vorausgesetzt, die vom LNP „gesehene“ Scherspannung bleibt auf dem gleichen Niveau wie in unseren Experimenten und die Strömungsbedingungen bleiben unterhalb der Turbulenz Beginn.

Schließlich können wir mithilfe der Erkenntnisse, die wir in dieser Arbeit gewonnen haben, versuchen, optimale Bedingungen für die Produktion von LNPs für den von uns verwendeten Mischertyp zu definieren. Erstens muss die Durchflussrate groß genug sein, um eine hohe Durchmischung zu erreichen. In unserem Fall kann eine Mindestflussrate von 4 ml/min vorgeschlagen werden. Zweitens sollte das Gerät lang genug sein, damit sich der Mischvorgang voll entfalten kann. Unsere Arbeit legt nahe, dass das Dreißigfache der Querabmessung akzeptabel ist. Schließlich muss der FRR groß genug sein, um die mittlere Polarität nahe an Wasser aufrechtzuerhalten, ohne mit hohen Verdünnungsfaktoren zu arbeiten, die Abfall erzeugen würden. In unserem System können wir eine FRR in der Größenordnung von 3 vorschlagen.

Der Artikel analysiert eingehend den Mischprozess, der sich entlang eines Geräts mit einer Y-Verbindung und vier Ringen entwickelt. Im LNP-Kontext ist dies eine Premiere. Das von uns analysierte Gerät gehört zur Kategorie der Trägheitsmikromischer, dh Mikromischer, die sich die Wirkung von Trägheitswirbeln (Dean) zunutze machen und in der Zwischenzeit unterhalb des Turbulenzbeginns arbeiten. Diese Mischer sind gut für hohe Durchsätze geeignet, eine Schlüsselvoraussetzung für die Massenproduktion. Solche Durchsätze können beispielsweise mit dem Fischgrät-Mikromischer nicht erreicht werden. In dieser Arbeit haben wir gezeigt, dass sich zeitabhängige Phänomene oberhalb eines bestimmten Schwellenwerts entwickeln, was der numerischen Arbeit von Minakov et al.18 nahe kommt. Unsere Analyse des Mischprozesses zusammen mit LNP-Messungen zeigt, dass die optimalen Bedingungen für die Herstellung funktioneller Strukturen Durchflussraten erfordern, die deutlich über dem Einsetzen zeitabhängiger Phänomene liegen. Der Grund dafür ist, dass oszillierende Wirbel, wie in der Literatur zum Thema Chaos nachgewiesen (siehe z. B. Ref. 19), zu einer effizienten Durchmischung führen. Wir schlagen vor, dass das hier vorgeschlagene Kriterium (das oberhalb des Beginns oszillierender Strömungsregime gilt) allgemeingültig ist. Es sollte für die Entwicklung von Hochdurchsatz-Mikromischern für die LNP-Produktion nützlich sein.

Die im Rahmen der aktuellen Studie analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Die Autoren danken La Ville de Paris, SANOFI, ESPCI, CNRS, PSL und IPGG für ihre Unterstützung. Sie danken den Mitgliedern der MMX-Gruppe für die Diskussionen und L. Dehove für die Zahlen.

Das Wort wird von CNRS, PSL, der IPGG-Plattform, ESPCI und einem Zuschuss von SANOFI unterstützt.

BioDPD-Abteilung, SANOFI, 13 Quai Jules Guesde, 94400, Vitry-sur-Seine, Frankreich

Manon Ripoll, Mathilde Enot, Oscar Robbe, Chiara Rapisarda, Jean-René Authelin, Mostafa Nakach und Pierre Wils

Mikrofluidik, MEMS, Nanostrukturlabor, CNRS Chemistry Biology Innovation (CBI), UMR 8231, Pierre Gilles de Gennes Institute (IPGG), ESPCI Paris, PSL Research University, 6 rue Jean Calvin, 75005, Paris, Frankreich

Elian Martin und Patrick Tabeling

REI-Abteilung, SANOFI Pasteur, 1541 Av. Marcel Mérieux, 69280, Marcy-L'Etoile, Frankreich

Marie-Claire Nicolai & Aurélie Deliot

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MR, EM, ME, OR, CR, MCN, AD führten die Experimente durch; PT, JRA, MN, PW diskutierten die Ergebnisse und leiteten das Projekt.

Korrespondenz mit Patrick Tabeling.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ripoll, M., Martin, E., Enot, M. et al. Optimale Selbstorganisation von Lipid-Nanopartikeln (LNP) in einem Ringmikromischer. Sci Rep 12, 9483 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13112-5

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Eingegangen: 09. Februar 2022

Angenommen: 20. Mai 2022

Veröffentlicht: 08. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13112-5

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